细胞计数是细胞培养过程中的重要步骤,“传统的细胞计数方法"是在显微镜下使用血细胞计数板人工计数。这里博大博聚为大家介绍下传统细胞计数的详细的步骤,供大家参考。
1、准备好血细胞计数板
1) 先用无水乙醇清洁血细胞计数板表面和盖玻片;
2) 再用纯水清洁血细胞计数板表面和盖玻片;
3) 每次清洗后用洗耳球吹干。
4) 在血细胞计数板的计数池上方盖上专用的盖玻片。
注意:最好不要擦拭血细胞计数板的计数池,防止标识线损坏。
2、制备细胞悬液
1) 贴壁生长的细胞,使用胰酶消化的方法使细胞从培养瓶表面脱落;
2) 漩涡混匀或使用移液器反复吹吸细胞悬液,尽量减少细胞团簇;
3) 悬浮细胞则可以直接进行取样计数;
4) 细胞悬液浓度控制在1×106个细胞/mL左右。
注意:
a) 尽量少、尽量小的细胞团簇;
b) 如需计算活率,则需将细胞悬液按照1:1的比例加入等量的0.4%的台盼蓝染料,混匀后,静置1~2分钟。
3、细胞加样
1) 移液器轻吹细胞悬液使其混合均匀;
2) 将细胞悬液与台盼蓝染料按1:1体积混合均匀;
3) 取出10uL细胞悬液,将细胞悬液滴加于血细胞计数板边缘凹槽处,此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池。
注意:
1) 每次加样前要混匀细胞悬液,防止细胞沉降造成取样误差增大;
2) 加样过程中,要一次性将细胞悬液注入计数室,防止气泡产生,否则要重做;
3) 加样时不要将细胞悬液直接吹入计数池,会造成细胞分布不均匀。
4、 人工细胞计数
计数工具:10X物镜的显微镜、血细胞计数板。
1) 加样后,将血细胞计数板静置数分钟;
2) 把血细胞计数板放置在显微镜的载物台进行观察-计数-记录;
3) 分别计数大方格1-2-3-4中的细胞总数。
注意:
1) 计数时建议重复1-2次,取平均值,减小计数误差;
2) 四个区域的细胞数量偏差不应超过 5%,否则要重新加样。
3) 对横跨刻度上的细胞,依照“数上不数下,数左不数右"的原则进行计数。
4) 为降低细胞计数误差,浓度最好控制在1×106个细胞/mL左右;
5) 计数时,只计数完整的细胞,如有聚团细胞则按一个细胞进行计数。
5、 血细胞计数板浓度计数标准
(中国的标准:JJG 552-1988血细胞计数板试行检定规程)
1) 如上图所示,当血细胞计数板放上盖玻片后,平台与盖玻片之间的距离 (即高度)为 0.1mm;
2) 平台中心部分各以3mm长,3mm宽精确划分为9个大方格,称为计数室,每个大方格面积为1mm2,体积为 0.1mm3;
3) 细胞浓度 (mL)=(四个大方格细胞数之和)/4X2(染液稀释倍数)X 104=?个细胞/mL。
注意:如果不加入台盼蓝染料,则无需乘以2。
相信有些小伙伴,即使花费很长时间熟悉,并实际接触细胞计数操作的全部流程后,还是会有结果不满意、人工操作效率低、结果无法一目了然、细胞计数数到“眼疼"的情况。
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7、血细胞计数板上机实拍图案例
8、细胞计数结果包括
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